□ 연구개요 본 연구는 혈관내피세포 산화질소합성효소 (endothelial nitric oxide synthetase, eNOS) 및 산화질소 (NO) 활성 억제가 주요 기전으로 밝혀진 폐동맥고혈압에서도 심혈관계 내피세포에서 산화질소의 활성 유지, 교감신경의 과활성화억제 및 산화스트레스 억제효과가 있는 dexmedetomidine (DEX)이 동일한 기전으로 폐동맥고혈압을 유효하게 억제할 수 있는지에 대해 밝히고자 한다. 또한, Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)와 Human pulmonary artery smooth muscle cells (HPASMC)에서 monocrotaline(MCT)에 의한 폐동맥 고혈압 발생에 있어서 자가포식의 활성화가 얼마나 중요하게 작용하고 그 기전을 확인하고자한다. □ 연구 목표대비 연구결과 1차년도 연구내용 및 결과 내용 : 혈관내피세포 (bEND.3, mouse brain endothelial cells)를 이용하여 MCT (0, 1, 2, 3, 4, 5 mM), dexmedetomidine (0, 1, 5, 10, 20 nM)을 처리하여 세포활성에 미치는영향과 세포사멸, 신호전달에 미치는 영향을 확인한다. 결과 : bEND.3 세포에서 MCT의 처리에 의한 세포분열 및 성장을 억제하는 것으로 관찰되었다. 3 mM이상의 농도에서는 유의적으로 세포성장이 억제되었다. DEX를 처리했을 때, 세포 성장에는 영향이 없음을 확인하였다. 또한, monocrotaline의 처리가 세포의 성장억제와 G2/M의 arrest를 일으키고, LC3B의 발현 변화를 보이고, 이는 PERK와 ERK의 signal이 autophagy와의 연관됨을 확인하였다. 2차년도 연구내용 및 결과 내용 : MCT에 의해 HUVEC세포와 PASMC세포에 세포성장 및 세포활성에 미치는영향과 세포사멸, 신호전달에 미치는 영향을 확인하고, autophagy가 일어나는 정확한 신호전달을 알아보기 위해, 연관된 신호전달의 억제제를 이용하여 확인한다. 결과 : HUVEC이나 HPASMC세포에서 MCT를 농도별로 처리했을 때, 세포 성장이 억제됨을 확인하였고, Autophagy마커인 LC3B가 농도가 증가할수록 증가되었고, DEX와 ERK inhibitor를 처리했을때 감소된 것으로 볼 때, 이는 MCT에 의한 autophagy가 ERK의 활성화에 의한 것임을 확인하였다. 또한, MCT에 의한 ERK의 활성화와, inhibitor인 3-MA와 Bafilomycin A1을 처리했을 때, LC3-II가 증가한 것으로 보아, HUVEC세포에서 MCT는 강력한 autophagy inducer로 작용하고 있음을 확인하였다. 3차년도 연구내용 및 결과 내용 : HUVEC셀에서 강력한 autophagy inducer로 작용하고 있는 MCT에 의한 autophagy와 연관된 gene screening을 통하여 DEX에 의한 억제효과와 연관된 특정한 signaling을 찾아 DEX처리에 의한 폐동맥 고혈압의 억제 기전을 확립하고자 한다. 결과 : Western blot과 immunofluorescence를 통해 MCT 처리에 의해 cytoplasm에 LC3B의 발현이 증가했음을 확인하였고, control에서는 lamp1이 핵에서 아주 약하게 관찰되었으나, MCT 처리했을 때, 세포질에서 강하게 발현되었고, DEX처리에 의해 그 현상이 완화 되었음을 확인하였고, merge에서 보면 발현되는 위치가 거의 동일함을 확인하였다. ERK inhibitor처리에 의해서도 완화됨을 보였지만 DEX의 효과가 더 좋았음을 확인하였다. 그러나 nuclear와 cyroplasmic fraction에서의 western 결과와 다소 차이를 보였지만, LC3B-I의 경우 cytosol에서 관찰되었고, LC3B-II의 경우는 control에서는 확인되지 않고, MCT처리했을 때, 약하게 핵에서 관찰되었다. 4차년도 연구내용 및 결과 내용 : HUVEC세포에서 MCT처리에 의한 endogeneous LC3B 단백질의 세포질로의 이동을 확인하고 DEX에 의한 억제효과가 있는지 확인한다. 세포를 안정화 시킨 후, DEX(10ug/mL)를 한시간 전처리 하고, MCT 5 mM을 처리하고 24시간 후에 Confocal을 이용해 LC3B punta와 autophagic flux, LC3B translocation을 확인한다. 결과 : HUVEC세포에 MCT를 처리했을 때, 세포질 부분에서 LC3B의 발현이 강하게 증가하고, DEX를 처리했을 때, 그 발현이 감소하는 양상을 보였다. mRNA의 발현을 확인한결과, TP53, p62, LC3B, GABARAPL1에서는 MCT처리한 세포에서는 발현이 증가했고, DEX를 처리했을 때, 유의적으로 감소했음을 확인하였다. CTSD와 HSP90AA1은 MCT에의해 증가했지만, DEX에 의한 유의적인 감소는 보이지 않았다. HUVEC세포에서 MCT에 의해 유도된 autophagy가 DEX처리에 의해 완화되는 세포내의 신호전달과 LC3B의 발현 증가도 중요하지만, 핵에서 세포질로의 이동에 관한 보다 깊은 연구도 필요함을 확인하였다. □ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성) MCT에 의해 유도된 폐동맥 고혈압 세포 모델인 HUVEC 세포에서 autophagy가 강하게 진행됨을 확인하였고, 이는 DEX의 처리에 완화될 수 있음을 본 연구를 통해 확인하였다. autophagy의 마터인 LC3B가 MCR처리에 의해 해 안에서 세포질로의 tranalocation이 일어남을 확인하였고, DEX에 의해 억제효과가 있음을 확인하였다. 이에 반해 본 연구에서 사용되는 dexmedetomidine의 경우 실제 임상에서 진정 및 진통 목적으로 사용하고 있기 때문에 본 연구결과를 바로 임상에 적용할 수 있다는 장점이 있다. 만약 DEX가 자가포식의 항상성을 유지시킴으로써 폐동맥고혈압의 발생을 억제할 수 있다고 밝혀진다면 DEX의 임상적 사용을 폐동맥고혈압 치료제로까지 확대할 수 있으며, 나아가 발생기전이 유사한 다른 다양한 만성 심혈관질환들(심부전증, 뇌혈관질환, 심근경색, 심부정맥, 뇌졸중, 심혈관계노화) 에도 적용해 볼수 있을 것으로 기대된다. (출처 : 연구결과 요약문 2p)
- 연구책임자 : 김남오
- 주관연구기관 : 연세대학교
- 발행년도 : 20210900
- Keyword : 1. 덱스메데토미딘;모노크로탈린;폐동맥고혈압;자가포식;항상성; 2. dexmedetomidine;monocrotaline;pulmonary artery hypertension;autophagy;homeostasis;
