□ 연구개요 열대식물(Calotropis procera R. Br.) 유래 시스테인 단백분해효소(cysteine protease) 저해제(inhibitor)인 SnuCalCpI의 단백질 3차구조를 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR) 분석을 통해 도출하고, 도출된 구조 정보를 바탕으로 표적 시스테인 단백분해효소인 카뎁신 L (cathepsin L)에 대한 결합 및 저해 특성을 molecular docking simulation을 통해 평가함으로써 SnuCalCpI의 시스테인 단백분해효소 저해 메커니즘을 규명하고자 함. 최종 목표를 달성하기 위한 단계별 세부목표는 다음과 같음. ⦁ 핵자기공명 분석을 이용한 SnuCalCpI의 단백질 3차구조 규명 ⦁ SnuCalCpI의 카뎁신 L 저해 메커니즘 규명 □ 연구 목표대비 연구결과 ⦁ pET32a vector 내 overlap 클로닝 및 담배식각바이러스 단백분해효소 분절부위(ENLYFQG)를 도입하여 제조된 SnuCalCpI 삽입 pET32a vector를 대장균(E. coli BL21(DE3))에 성공적으로 형질전환 후
15NH
4가 보충된 배지에서 발현된
15N 표지 SnuCalCpI03 및 SnuCalCpI15 단백질을 성공적으로 분리·정제함. ⦁ SnuCalCpI는 시스테인 단백분해효소 파파인 superfamily 내 카뎁신 L 유사 단백질의 I29 도메인으로써 알파-나선 구조로 예측되는 진화적으로 보존된 유전자 서열을 가지고 있으며, 원편광 이색성 분석을 통해 전형적인 알파-나선 구조의 형태임을 확인함. ⦁
15N-labeled SnuCalCpI 단백질의 이핵 단일 양자 일관성 분광 핵자기공명 분석을 다양한 분석 조건에서 진행하였으나 backbone assignment를 위한 전체 residue peak 관찰은 어려웠음. 따라서 SnuCalCpI 유전자 서열을 바탕으로 trRosetta 딥러닝 기반의 molecular modeling을 통해 SnuCalCpI의 단백질 3차구조를 성공적으로 규명함. ⦁ SnuCalCp03 및 SnuCalCp15으로부터 I29 도메인인 SnuCalCpI 구조만 선택적으로 추출하여 카뎁신 L (3F75) 구조 내 C1A 도메인과의 molecular docking simulation을 PIPER 알고리즘이 탑재된 ClusPro를 기반으로 진행하였고, SnuCalCpI의 ERFNIN 및 GNFD 모티프로 이루어진 알파-나선 구조가 카뎁신 L의 활성 부위에 경쟁적으로 결합함으로써 효과적으로 저해할 수 있음을 밝혀내었음. □ 연구발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성) 본 연구개발과제는 열대식물로부터 발굴된 카뎁신 L 저해 기반의 신규 천연 항암 소재인 SnuCalCpI의 작용 메커니즘을 분자적 수준에서 구조학적으로 규명함으로써, 기존 화학약품 소재의 내성, 체내 잔류, 부작용 등의 한계를 극복하면서 항종양능을 보유한 천연암 전이 억제제의 활용가능성을 높여줄 수 있는 과학적 근거를 마련함. (출처 : 연구결과 요약문 2p)
- 연구책임자 : 장판식
- 주관연구기관 : 서울대학교
- 발행년도 : 20210300
- Keyword : 1. 시스테인 단백분해효소 저해제;저해기작;구조분석;핵자기공명 분광 분석법;분자결합 모의실험; 2. Cysteine protease inhibitor;Inhibition mechanism;Structural analysis;NMR spectroscopy;Molecular docking simulation;