□ 연구개요 이 연구는 전사 활성에 의한 유전체불안정성이 증가되는 현상을 기작적으로 이해하는려는 노력임. 최근 Topoisomerase IIβ (TOP2B)의 효소기작이 스트레스에 의해 발현되는 다양한 유전자들의 (이후: 스트레스 유전자) 전사 활성과 더불어 요구되는 것이 알려지게 됨. 따라서 인간의 세포내에서 전사 활성에 동반하는 TOP2B의 활성 및 DNA와의 결합을 조절하는 기작을 밝히기 위해 노력했음. □ 연구 목표대비 연구결과 본 연구를 통하여 우리는 TOP2B ubiquitination을 확인하고 BRCA1-BARD1-TOP2B 상호작용의 기능적 분석을 목표하였음. 세부적으로 1. His-tagged 재조합 단백질을 클로닝하고 세균에서 발현, 정제하기를 계획하였었음. 우리는 BARD1과 TOP2B, 또한 BRCA1 단백질 및 BRCA1 S1524A, S1524D 돌연변이를 정제할 수 있었음. 2. TOP2B C-terminal domain truncated protein 정제할 수 있었음. 3. 가장 중요한 목표로서 우리는 in vitro ubiquitination 실험을 통하여 BRCA1-BARD1 결합체가 TOP2B를 ubiquitination 하는지, 또한 어떤 부분에 ubiquitination이 일어나는지를 밝히기를 목표하였었음. 이 연구 기간을 통하여 우리는 BRCA1-BARD1 결합체가 TOP2B를 ubiquitination하는 것을 보일 수 있었음. 특히 TOP2B 1-566 amino acids에서 ubiquitination이 일어나는 것을 확인할 수 있었음. 하지만 C-terminal domain을 cloning 하는 것을 실패하여 이 부분에도 ubiquitination이 일어나는 지에 대한 검증까지 하지는 못했음. 흥미있게도 BRCA1 S1524A이 WT이나 S1524D보다 월등한 TOP2B ubiquitination을 매개하는 것을 증명할 수 있었음. 4. 우리는 BRCA1 S1524 인산화가 TOP2B의 유전자 부착과 TOP2B ubiquitination에 어떤 영향을 주는 지는 HEK293 세포에서 Immobilized template assay 와 Western blot 등의 방법으로 확인하고자 하였음. 이에 따라 정제된 WT, S1524A, S1524D 돌연변이와 HeLa nuclear extracts, EGR1 유전자 DNA를 가지고 실험함에 의해서 S1524A를 첨가하였을 때 TOP2B의 EGR1 부착이 가장 증가함을 보일 수 있었음. 이 결과는 S1524A 돌연변이가 TOP2B ubiquitination을 활성화시키는 것과 연관시켰을 때 TOP2B ubiquitination이 DNA에 부착을 증가시킨다는 것을 제시할 수 있음. 또한 Caffeine과 ATM 등의 화학적 저해제를 사용하였을 때 BRCA1의 인산화가 저해되는 것을 보였음. 하지만 BRCA1 인산화와 TOP2B DNA 부착사이의 직접적인 결과를 확인하지 못하였고 아직 시도하는 중임. □ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성) 본 연구를 통하여 다양한 스트레스에 의해 유도되는 유전자들의 전사 활성에 동반하는 TOP2B에 의한 DNA 절단이 복구되는 기작을 이해하는 중요한 요소들을 제공하게 되었음. 우리는 선행 연구에서 BRCA1의 활성화 (인산화)가 대표적인 스트레스 유전자인 EGR1, JUN, FOS, MYC 등의 유전자들에서 일어나며, BARD1-TOP2B 상호작용이 BRCA1 인산화에 의해 조절된다는 것을 발견함, 결국, BRCA1-BARD1이 TOP2B의 EGR1 프로모터 부착을 조절하는 것으로 보였는데, 본 연구를 통하여 BRCA1-BARD1이 TOP2B에 의한 E3 ligase이며 TOP2B DNA 부착에 조절을 한다는 것을 밝힘. 이러한 이해는 전사의 조절, 나아가 유전자 발현의 조절과 전사와 동반된 유전체 불안정성을 이해하는데 중요할 것으로 생각됨. 본 연구실에서 최초로 발견된 전사효소 프로모터 부위 멈춤 풀림에 동반한 TOP2B에 기인한 DNA 절단과 복구 시그널링을 계속적으로 이해하여 이 분야를 선도하는 꼭 필요하고 중요한 연구로 더 발전시켜 나갈 수 있을 것이라 여겨짐. (출처 : 연구결과 요약문 2p)
- 연구책임자 : 번치 희연
- 주관연구기관 : 경북대학교
- 발행년도 : 20210600
- Keyword : 1. 전사조절;유전자발현;전사와 동반된 유전체불안정성; 2. Transcriptional regulation;Gene regulation;Topoisomerase IIb;Transcription-co upled genomic instability;BRCA1-BARD1;