□ 연구 목표 및 내용 ○ 최종 목표 본 연구의 최종목표는 인체 내에 두 번째로 많이 존재하는 (1) 무기질 형태인 휘트로카이트(Whitlockite) 나노 입자 및 생체 적합 고분자 등을 합성/이용하여, 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells)의 (2) 골 분화 (Osteogenesis) 를 촉진하고, 혈관내피세포(Endothelial cells)의 3차원 네트워크 형성을 통해 파골세포 (Osteoclasts) 및 조혈모줄기세포 (Hematopoietic stem cells)를 리쿠르팅 (Recruiting)을 유도하여 골 환경과 가장 유사한 플랫폼인 골 오가노이드 (Bone Organoid)를 만드는 데에 있음. ○ 전체 내용 효과적인 골 조직공학 및 더 빠른 골 재생재료로써 이용 가능하며 조혈모세포의 Education 및 골 생물학 또는 발생학 (Bone developmental biology)의 메커니즘을 밝히는 데에 큰 역할을 할 것으로 예상함. 본 연구의 목표를 위하여 생체재료와 인간 골 유래 중간엽 줄기세포, 혈관 내피세포, 조혈모세포가 고유하게 골 생식을 조절하는 핵심요인 (Critical factors) 골 유도 인자를 설명하기 위해 다음과 같은 단계적인 목표를 세우고 있음. ○ 1단계 ● 연구 목표 무기질이 포함된 생체재료를 이용한 혈관내피세포 및 중간엽 줄기세포의 생체고분차의 크라이오겔을 통한 3차원 배양을 통해 혈관 네트워크를 포함하는 오가노이드를 설치류의 피하에서 골 재생 구현 기술 개발 및 중요한 크기의 뼈 결함을 치료할 수 있는 인간 유래 혈관내피세포 및 중간엽 줄기세포, 무기질 생체재료의 최적화 된 비율 검증 및 복합체의 효율 확인. 골 환경안에서 여러 세포와 생체물질 간의 체내 골 유도를 일으키는 특정한 유전자 확립연구. ● 연구 내용 1차 연도 연구내용: 혈관 네트워크를 포함하는 골 오가노이드 기술 개발 확립 -동물모델을 통해 1) 골 유래 중간엽 줄기세포가 혈관내피에서 파생된 파라크린 (Paracrine) 인자에 의해 규제되고, 2) 인간 유래 골 혈관내피세포에 의해 정렬된 혈관 네트워크는 자연적으로 체내 골 생식을 유발하는 연구를 진행하였음. 이처럼 무기질 생체재료와 세포뿐만 아니라 인간 유래 혈관내피세포와 줄기세포를 포함하는 생체공학 혈관 이식술을 진행하여, 1) 골 유래 중간엽 줄기세포의 생체재료는 통한 혈관내피세포 의존, 2) 두 세포의 비율과 세포 밀도가 혈관 및 골 생성에 미치는 영향, 3) 설치류의 장기간 오가노이드의 이식을 통한 골 생성능력을 확인. -이 결과를 얻기 위해, 1) 형광 발현 이미지 처리 및 특정 유전자의 단백질 레벨 확인, 2) Luciferase 기반 생물 발광 및 3) Micro-CT를 활용하여 최대 12주 동안 정방향으로 혈관, 골유발 활동 및 골 재생 화를 모니터링. 2차 연도 연구내용: 최적화된 오가노이드를 통한 중요한 크기의 뼈 재생 -체내 중요 크기의 골 유도 잠재력을 담당하는 세포와 생체물질 사이의 특정 요인을 규명. -최적화된 오가노이드의 개발은 단순히 재료 개발에만 좌우되는 것이 아니라 세포와 재료 사이의 Interaction을 이해하고 실험을 진행하여, 1) 골격 결함 동물모델을 통한 제한적인 골 재생 유도, 2) 세포의 특정 유전자 제어 및 과발현을 통한 최적화된 골 재생, 3) 설치류의 이식을 통한 골 재생의 지속성 및 분화 가능성, 4) Host 세포와의 crosstalk 등을 확인함. -이 결과를 얻기 위해, 1) 설치류의 두개골 및 Femur 결손 모델 활용, 2) siRNA 및 shRNA를 이용한 특정 유전자의 Knockout 및 3) RNAseq, Protein array 등을 활용하여 혈관재생, 골 유발 활동 및 골 재생 화의 기작을 검증. 3차 연도 연구내용: 오가노이드의 조혈모줄기세포 리쿠르팅에 관한 연구 -최적화된 오가노이드를 통한 Host 유래의 조혈모줄기세포의 리쿠르팅 메커니즘을 규명하고자 함. 개발된 오가노이드를 통하여 조혈모줄기세포의 이동 및 행동을 관찰, 1) 조혈모줄기세포의 수용체 inhibition을 통한 세포 간의 crosstalk 금지, 2) 조혈모줄기세포에게 영향을 끼치는 단백질 존재 유/무를 통한 오가노이드의 변화 관찰, 3) 타 세포 유전자 조작을 통한 조혈모줄기세포의 리쿠르팅을 극대화하는 실험 등을 진행. -이 결과를 얻기 위해, 1) shRNA 및 CRISPR/Cas9을 통한 유전자 제거 및 삽입, 2) Recombinant 단백질 프로 파일, 3) RNAseq, Protein array 등을 활용하여 조혈모줄기세포의 미세환경체제를 검증. ○ 2단계 ● 연구 목표 세포와 생체재료의 최적한 조건확립 연구를 바탕으로, 생체 내에서 골 오가노이드로 인한 조혈모세포의 리쿠르팅 및 조혈모세포로서의 분화 체제 메커니즘 확립. 골 오가노이드의 활용을 위한, 뼈암 전이 모델에 활용 및 조혈모세포의 배양 환경을 조성하여 치료제로서의 플랫폼 제작 기술 개발. 개발된 골 오가노이드 플랫폼을 통한, 골의 발생기전 및 생체 내에서의 복합적 미세 골 환경 제어 연구. ● 연구 내용 4-5차 연도 연구내용: 골 오가노이드의 활용을 위한 플랫폼 제작 기술 개발 -생체 내 조혈모줄기세포의 리쿠르팅 및 배양모델을 확인하기 위해 형질전환 마우스 및 Radiation을 통해 조혈모줄기세포를 제어하여 제작된 오가노이드의 역할을 확인할 수 있음. -질환 모델의 메커니즘 및 배양 플랫폼을 검증하기 위해, 세포의 이동 및 병리학을 통해 상태를 확인할 예정임, 또한 단순히 세포 단위에서의 영향력을 확인하는 것이 아니라, 조혈모관련 질환 치료에도 효율을 나타내는지 확인할 예정임. -이 연구를 바탕으로 제작된 오가노이드가 1) 생체 내에서 골 생성에 어떠한 단계를 거쳐 주변 환경을 구성하는지 또한 2) 조혈모줄기세포를 어떻게 리쿠르팅 및 Education 하는지, 마지막으로 3) 이 세포들이 미세 골 환경을 어떻게 제어하는지에 대한 연구를 진행할 예정임. □ 연구성과 본 연구팀은, 혈관내피세포와 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 오가노이드를 개발하였으며, 이 오가노이드는 골 재생을 촉진하는 효과가 있음을 확인했음. 혈관내피세포가 분비하는 KITLG가 Host 유래의 조혈모세포를 리쿠르팅하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 입증했음. 혈관내피세포가 조혈모세포의 골화 분화를 촉진하는 데 중요한 역할을 한다는 것 또한 입증하였음. 조혈모세포의 niche와 관련된 유전자를 분석하여, 골 환경을 유지하는 혈관 환경을 조성하기 위한 유전자를 밝혀냈음. 1단계 (1-3년차)에서는 총 5편의 SCI급 논문을 게제하였으며, 32번의 국제학술대회 및 학술대회 발표를 통해 학회 및 여러단체에서 총 10번의 우수연구상 및 포스터상을 수상하였음. 2단계에서는 총 6편의 논문을 추가로 게제할 예정에 있으며, 국제학술대회 및 국내학술대회에서 연구 내용 발표 계획을 가지고 있음. □ 연구성과의 활용 계획 및 기대효과 본 연구를 통해 개발된 생체모방형 합성 무기 나노 입자를 함유한 오가노이드는 선천적 장애, 사고, 암 혹은 노화로 인한 골 손상 혹은 결손 환자들에게 경제적 부담이 없는 고성능의 골 재생치료 플랫폼으로 활용될 수 있음. 현재 골 오가노이드 분야에서 국내외에서 선도적인 기술과 기업이 없음. 따라서 생체모방 나노 입자 기반의 골 오가노이드를 통한 플랫폼 개발은 기술 우위 확보를 통한 세계시장 주도 가능-의학, 생명과학, 화학공학, 기업으로 이루어진 산학 병이 밀접히 연관될 수 있는 융합 과학으로 효율적인 협동 연구를 통해 국내 첨단 바이오 및 의료기기, 소재 부분에서 기술 경쟁력을 강화할 수 있음. 본 연구에서 개발된 골 오가노이드 플랫폼는 골 관련 치료 연구를 발전하는 데에 이바지할 수 있으며, 치료제 개발 분야에서도 유용하게 쓰일 것이라 예상됨. 미세 골 유사 환경을 통해, 골 재생의 메커니즘을 정확히 파악하여 더 효율적인 재생의학 프로토콜을 제시할 수 있을 것. 본 연구에서 초래된 결과들은 다양한 질병 모델에 새로운 치료법을 제시할 것이며, 기술의 미래원천기술 확보가 가능할 것으로 예상함. 선진국 고령 시대에 들어오면서 골 관련 질환이 증가하는 사회에서 직접 골세포의 행동 및 골환경을 구현해 낼 수 있는 기술은 앞으로 골 관련 질환의 메커니즘을 밝혀낼 수 있는 매우 혁신적인 신기술이라 여겨짐.이는 골수의 조혈모줄기세포 관련 질환 (백혈병, 림프종, 고형암, 빈혈, 면역 부전, 선천성 대사 장애) 등으로 고통을 겪는 수많은 환자의 삶의 질을 획기적으로 증대시킬 것으로 기대함.또한, 본 기술을 골세포 외 다른 세포를 적용한다면 다양한 질병의 치료에도 응용할 수 있음. (출처 : 요약문 2p)
- 연구책임자 : 김환
- 주관연구기관 : 한국교통대학교
- 발행년도 : 20240300
- Keyword : 1. 골 오가노이드;골조직공학;조혈모줄기세포 공학;골 발생학;골 생체재료; 2. bone organoid;bone tissue engineering;hematopoietic stem cells engineering;bone developmental biology;bone biomaterials;
