□ 연구개발 목표 및 내용 ■ 최종 목표 DNA 복제실수교정 (mismatch repair; MMR) 유전자 변이에 따른 방사선에 의한 유전체 돌연변이 유발 정도를 마우스 정상 대장 조직 및 인체 정상 대장 조직에서 유래한 오가노이드의 전장유전체 염기서열분석(whole-genome sequencing; WGS)을 이용하여 단일 세포 수준에서 확인한다. ■ 1단계 ■ 목표 MLH1
+/-, MLH1
-/- 마우스의 대장 오가노이드를 활용하여 in vitro, in vivo 방사선 조사 후, 방사선에 의한 유전체 돌연변이 차이를 정상 마우스와 비교한다. ■ 내용 1. MLH1
+/+, MLH1
+/-, MLH1
-/- 세 군의 마우스에서 정상 대장 오가노이드 확립, 일정 시간 배양 후 (2 개월) 유전자 돌연변이 분석 및 in vitro 방사선 조사 (0, 8Gy) 후 유전체 돌연변이 분석 2. 마우스 세 그룹에서 in vivo 방사선 조사 후 (0, 8Gy) 대장 오가노이드 배양, 유전체 돌연변이 분석 3. 유전체 돌연변이 분석은 오가노이드의 단일세포 분리, 클론배양 후 whole-genome sequencing을 통하여 단위 베이스 당 돌연변이양, microsatillite instability (MSI) 및 유전체 변이 특성(mutational signature) 분석 ■ 2단계 ■ 목표 인체 정상 대장 오가노이드를 확립하고, 유전자가위(Crispr/Cas9) 를 통해 MLH1 유전자 변이를 유도, in vitro 방사선 조사 후 유전체 돌연변이 차이를 확인한다. ■ 내용 1. 인체 정상 대장 오가노이드에 유전자가위(Crispr/Cas9)를 이용하여 MLH1
+/-, MLH1
-/- 오가노이드 확립 - 대장절제술을 시행한 인체 대장 검체로부터 정상 대장 오가노이드 배양 -MLH1 유전자 변이를 유도하는 guide RNA를 제작하고 Crispr/Cas9을 이용하여 MLH1 유전자 변이가 유도된 오가노이드 확립 2. MLH1
+/+, MLH1
+/-, MLH1
-/- 인체 대장 오가노이드에서 in vitro 방사선 조사 (0, 8Gy) 후 whole-genome sequencing을 통해 유전체 돌연변이 차이 비교분석 □ 연구개발성과 ■ 정상 마우스 대장 오가노이드 확립 및 in vivo, in vitro 방사선 실험을 통해 상기 방법론으로 방사선에 의한 특이적 유전자 변이 측정이 가능함을 확인함 ■ MLH1 +/- embryo를 도입하여 배앙을 통해 MLH+/-, MLH-/- 마우스 생산에 성공함 ■ 정상 인체 대장 오가노이드 배양에 성공하여 후속연구에 대한 기반을 마련함 □ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과 ■ 오가노이드를 이용하여 방사선의 돌연변이 유발 정도를 측정하는 방법론은 향후 방사선유발 돌연변이 측정에 많은 도움이 될 것으로 사료됨 ■ 대장암의 MMR 유전자 변이외에도 유방암에서 BRCA1/2 변이 등 DNA repair 유전자의 변이가 암 발생에 중요한 역할을 하고 있어 이러한 유전자의 변이가 있는 암환자들에서 방사선으로 인한 이차암 발생 여부 및 방사선 민감성/저항성 여부는 개인 맞춤형 치료에 매우 중요한 요소로, 본 연구 방법이 널리 응용될 수 있으리라 생각함. (출처 : 요약문 2p)
- 연구책임자 : 김경수
- 주관연구기관 : 이화여자대학교
- 발행년도 : 20220300
- Keyword : 1. 방사선치료;오가노이드;복제실수교정유전자;린치증후군;전장유전체분석; 2. Radiotherapy;Oragnoid;Mismatch repair gene;Lynch syndrome;Whole genome sequencing;