□ 연구 목표 및 내용 ◼ 최종 목표 - 최종 목표 간암 동물모델을 활용하여 8-oxo-dG(8-hydroxy-2’-deoxoguanine) 산화 손상과 핵막단백질 Lamin의 상호작용을 유전체 수준에서 밝히고 이를 ‘Lamin의 유전체 안정성 유지를 위한 산화 손상 복구 기작’으로 이해함으로써, 간암 진단 및 치료에 새로운 접근방안을 제시하고자 함. - 세부 목표 1. 간암에서의 발달 단계별 8-oxo-dG 유전체와 Lamin 핵막 단백질과의 상호결합 및 인터렉톰 분석 2. Lamin을 통한 8-oxo-dG 복구 기전 규명 3. 간암 환자 유전체분석을 통한 Lamin 매개 발암성 8-oxo-dG 돌연변이 규명 이러한 목표를 위하여, 1) 산화스트레스 유도 약물(DEN)을 투여하여 제작한 간암 동물 모델을 활용하여 NGS 분석을 수행함으로써, 2) 간암 유전체내 8-oxo-dG 분포를 관찰하고, 3) 유전체-핵막단백질의 상호작용을 통한 DNA 복구 메커니즘을 규명하여 간암의 진단과 치료에 응용 가능한 이론을 제시하고자 함. ◼ 전체 내용 - 연구배경: 발암 과정에서 산화스트레스로 인한 DNA 산화 손상 (8-oxo-dG)이 C가 아닌 A와 염기배열하여 체세포 돌연변이를 형성하면서 암 발달의 원인으로 지목되었으나, 유전체 수준에서의 정확한 위치와 복구과정, 핵막 내부의 공간적인 분포에 대해서는 전혀 알려지지 않음. 따라서, 본 과제책임자의 DNA 손상 및 복구 연구에 대한 전문성과 소속 연구진이 개발한 8-oxo-dG 시퀀싱 기술을 기반으로, 간암 생성 시발생하는 8-oxo-dG 유전체 서열과 산화스트레스에 의해 핵 안을 구획화하는 Lamin과의 연관성을 유전체 수준에서 분석하고, 이를 통해 Lamin의 DNA 손상 복구 기능에 대한 분자생물학적 기작을 규명하여, 산화스트레스로 인한 간암 발달 기전을 규명하고자 함. - 연구내용: 1. 간암유전체분석을 통해 Lamin 매개 8-oxo-dG 복구 기전을 규명하고, 산화스트레스로 인한 Lamin 결함이 8-oxo-dG 형성에 미치는 영향을 확인하여 간암의 발달 기전을 규명 - NGS 분석을 통해 간암의 발달단계에 따른 8-oxo-dG과 lamin의 분포를 분석함으로써 8-oxo-dG 복구과정에서 Lamin의 기능과 역할에 대한 가설 확립 - Lamin 결함이 8-oxo-dG 증가 및 8-oxo-dG와의 상호작용에 미치는 영향 관찰 - 간암세포를 활용하여 산화스트레스로 인한 Lamin 연관 간암 발달 기전 규명 2. 생체 모델을 활용하여 Lamin의 유전체 안정성 유지 기전을 검증하고, 간암 환자조직의 유전체를 분석하여, 1단계 연구를 통해 규명한 Lamin 관련 간암 발달 기전의 유효성을 평가 - Xenograft mouse 모델을 활용하여 Lamin에 의한 8-oxo-dG 복구 및 간암 발달 기전 검증 - 간암 환자조직의 유전체 분석을 통해 Lamin 매개 8-oxo-dG 복구 기전 검증 및 간암 돌연변이를 발굴 ◼ 1단계 ❏ 연구 목표 Lamin과 8-oxo-dG의 상호결합 및 관련한 간암 발달 메커니즘을 밝히고, 간암 발달단계별 유전체 정보를 생산하여 이를 다각도로 분석하고자 함. 1. Lamin 단백질의 인터렉톰 분석 - 전사체 분석을 통해 Lamin의 기능 및 관련 메커니즘에 대한 정보 수집 - 간암 발달단계에 따른 Lamin의 발현량 및 결합단백질 비교 관찰 2. 간암 동물 모델의 유전체 분석 - 간암 발생 생체모델의 유전체 내 8-oxo-dG 분포를 분석 - Lamin과 8-oxo-dG 사이의 관련성 도출을 위한 Lamin ChIP-seq 수행 및 8-oxo-dG 분포와의 비교 분석 3. Lamin과 8-oxo-dG의 연관관계를 설명하는 메커니즘 규명 - Lamin에 대한 8-oxo-dG의 결합력 분석 - 유전체 내 Lamin과 8-oxo-dG의 결합을 설명하는 가설 수립 - 간암 발달에 따른 Lamin과 8-oxo-dG간 결합력의 변화 유무 관찰 - Lamin과 8-oxo-dG 간의 상호작용이 간암 발달에 미치는 분자생물학적 메커니즘 규명 ❏ 연구 내용 1. Lamin의 인터렉톰 분석 Lamin과 8-oxo-dG의 상호작용 연구 시작 전, Lamin에 대한 사전 정보를 수집하고자 함. - Lamin 연관 전사체 분석(RNA-seq)을 통해 Lamin이 DNA 손상 복구, 지질 대사, 스트레스 반응 등에 관여하는 유전자군의 발현을 조절하는 것을 확인함 - 간암 발달 단계에 따른 Lamin의 발현량 변화 및 결합 단백질의 변화는 관찰되지 않음 - Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Dot blot을 통해 LaminA와 8-oxo-dG와의 강한 결합을 관찰 2. 인간 간암세포주 유전체정보 분석 간암 동물모델의 유전체 정보와의 비교분석을 위해 인간 간암 세포주의 유전체 분석 진행 - 항체를 이용하여 8-oxo-dG-IP-seq을 수행, 8-oxo-dG의 유전체 내 분포 확인한 결과 LINE(Long interspersed nuclear element) 서열에 8-oxo-dG 수준이 높게 나타남 - Lamin ChIP-seq 결과, LINE, SINE(Short interspersed nuclear element) 및 Simple repeat 서열에 Lamin이 강하게 결합하는 것을 관찰 3. 간암 동물 모델의 유전체 분석 간암 발달 단계에 따라 Early, Mid, Late 시기의 마우스 간 조직에서 추출, Lamin과 8-oxo-dG의 분포를 확인하고, 연관 관계를 확인하고자 함 - Mid 시기에 8-oxo-dG 수준이 가장 높았으나, 유전체 전반에 산재하여 발생함 - 인간 간암 유전체 분석 결과와 동일하게 8-oxo-dG이 LINE 서열에서 가장 많이 발생하였음 - Lamin ChIP-seq 분석 결과, Lamin 또한 LINE 서열에 밀집하였으며, 8-oxo-dG와 Lamin이 LINE에서 co-localize함을 확인함 4. Lamin과 8-oxo-dG의 결합친화도 분석 면역침강법을 이용하여 Lamin이 Guanine보다 8-oxo-dG에 더 강한 결합 친화도를 보임을 확인함으로써, Lamin이 LINE 서열에 존재하는 8-oxo-dG의 복구 과정에서 기능할 것이라는 가설을 세움 5. Lamin에 의한 간암 발달 기전 동물 모델의 간암 조직에 siRNA를 처리하여 간암세포에서 Lamin의 발현을 억제하였을 때 간암의 발달이 저해됨을 확인함으로써, Lamin이 새로운 항암 타겟으로 응용될 수 있음을 시사함 ◼ 2단계 ❏ 연구 목표 분자생물학 수준에서 규명한 Lamin과 8-oxo-dG에 의한 간암 발병 기전을, 동물모델 및 간암 환자 유래 간세포 분석을 통해 검증하고자 함. Lamin과 8-oxo-dG의 상호작용에 의한 간암 발달 기전을 검증하고, 간암 발암성 돌연변이 발굴을 통해 핵막단백질 Lamin이 간암의 발달에 미치는 영향을 밝히는 것을 목표로 함 1. Lamin 매개 8-oxo-dG 복구 기전의 생체 내 검증 - 1단계 연구에서는 Lamin과 8-oxo-dG의 상호작용과 관련한 간암 발병 메커니즘을 규명하고, 2단계 연구에서 이를 동물모델에서 검증하고자 함 - Lamin 돌연변이 간암 세포주와 환자 유래 간암 세포주를 이종이식하는 Xenograft mouse 모델을 활용하여 Lamin 관련 간암 발달 기전 검증 2. 간암 발암성 돌연변이 발굴 - 간암 동물 모델의 전장 유전체 데이터 분석을 통해 Lamin 관련 발암성 돌연변이 발굴 - 간암 환자의 전장 유전체 데이터 생산 및 분석을 통해 Lamin 관련 돌연변이의 인체 내 유효성 검증 ❏ 연구 내용 간암 동물모델과 인간 간암 세포주에서 공통되는 ‘Lamin 매개 8-oxo-dG 복구’ 메커니즘을 밝혀, 최종적으로 간암 환자 조직의 유전체정보 분석을 통해 메커니즘의 인체 내 유의성을 검증할 예정임 1. Lamin의 8-oxo-dG 복구 및 LINE의 발현 억제 기전을 분자생물학적 실험 방법을 통해 세포 수준에서 규명할 계획임 - 인간 간암 세포주 HepG2와 Huh7에서 Lamin에 의한 8-oxo-dG 복구 기전 및 유전체 안정성 유지 기전을 검증할 예정 - 간암 발달 동물 모델에서 발달 단계별 LINE의 발현량 및 활성을 RNA-seq, Western blot 등의 실험을 통해 비교 예정 - 간암 세포주를 활용하여 Lamin과 LINE의 발현 조절을 통한 간암의 발달 기전 검증을 계획 2. 동물 실험 및 간암 환자조직의 유전체 분석을 통해 메커니즘의 유의성을 검증할 예정임 - 간암 동물모델의 전장유전체 분석을 진행하여 간암에서 LINE이 insertion 된 genomic region을 탐색하고, RNA-seq을 통해 이러한 insertion이 종양 관련 유전자에 미치는 영향 탐색 - 동물모델에서 탐색한 LINE의 insertion region을 간암 환자조직의 유전체 분석을 통해 검증 - 8-oxo-dG 복구 기능에 이상을 보이는 Lamin의 돌연변이 간암 세포주를 동물 세포에 이식하는 Xenograft model을 활용하여 Lamin에 의한 간암 억제 기전 검증 □ 연구성과 1단계 연구결과 Lamin의 발현을 조작한 세포의 전사체분석을 통해 Lamin과 DNA 손상 복구의 연관성을 관찰하고, 유전체 분석을 통해 LaminA 단백질과 8-oxo-dG가 LINE 서열에 밀집함을 확인함. 결합친화도 분석실험을 수행하여, LaminA가 Guanine보다 8-oxo-dG와 강하게 결합하는 것을 관찰함. 연구결과와 선행 논문의 종합적인 분석을 통해, LaminA가 SIRT6와 상호작용하여 LINE 서열에 존재하는 8-oxo-dG의 복구에 기능할 수 있음을 확인함. 더불어 마우스 모델을 이용한 간암 발병 실험을 통해 간암세포에서 LaminA의 발현 억제 시 간암의 증식이 저해됨을 관찰하여, LaminA를 새로운 항암 타겟 단백질로서 제안함 2단계 연구에서는 ‘Lamin을 매개로 한 8-oxo-dG의 손상 복구’ 기전을 세포 및 동물 실험을 통해 규명하고, 간암 환자 조직에서 검증하여 간암 발달 기전에 대한 이해와 간암 치료에 새로운 접근 방안을 제시할 수 있을 것으로 기대함. □ 연구성과의 활용 계획 및 기대 효과 1. 간암 항암제 개발에 활용 가능한 기초 메커니즘 확립 간암의 발달과정에서 산화스트레스로 인해 생성되는 DNA 손상이 미치는 영향에 대한 분자생물학적 메커니즘을 제시함으로써, 향후 간암의 치료를 위한 항암제 개발에 응용 가능함 2. 양질의 간암유전체정보 생산 및 분석 단계별 간암 발병 모델을 이용한 NGS 분석을 통해 후속 연구를 활성화할 양질의 빅데이터를 생산하여 제공하고, 간암을 유도하는 발암 돌연변이를 발굴함으로써 간암의 진단기술 개발에 활용 가능한 데이터베이스를 구축할 것으로 기대 3. 암 연구에서 핵막과 DNA 복구기전을 융합한 창의적인 연구 분야 개척 단백체와 유전체 연구를 융합하여, 핵막이 구조적, 생리학적인 다각적 기능을 통해 산화스트레스에 대응하는 메커니즘을 규명함으로써, 핵막 단백질이 간암의 발달에 미치는 영향에 대한 창의적이고 도전적인 새로운 연구영역을 개척할 것으로 기대 (출처 : 요약문 2p)
- 연구책임자 : 함자영
- 주관연구기관 : 고려대학교
- 발행년도 : 20231200
- Keyword : 1. 간암;차세대염기서열분석;산화 DNA 손상 복구;간암동물모델; 2. Hepatocellular carcinoma;Oxidative DNA repair;NGS;DEN-induced liver cancer model;LINE;
